1. 简介
蛋白质是生物体内的重要成分，其含量与某些生理功能紧密相关。因此，测定蛋白质含量是生物学、化学、药学等多个领域的基础工作之一。目前，人们广泛使用的测蛋白质方法有很多，其中Bradford法和肽键定量法是较为常用的两种方法。本文将分别介绍这两种方法的理论原理、操作流程和优缺点。
2. Bradford法测蛋白质含量
Bradford法是一种最常用的测定蛋白质含量的方法之一，它基于酸性条件下Coomassie Brilliant Blue G-250与蛋白质的非共价结合，形成可检测的复合物，从而定量测定样品中蛋白质的含量，测量结果与蛋白质的种类无关。这种方法操作简单、使用方便、结果稳定，适用于大部分生物样品的测定。
具体操作流程如下：
制备蛋白质样品：取所需数量的生物样品，如细胞培养物、组织、血清等，样品应较为纯净。
制备标准曲线：采用已知浓度的蛋白质标准品，制备一系列已知浓度的标准曲线。
加入Coomassie Brilliant Blue G-250试剂：向每个样品和标准品试管中分别加入Bradford试剂（含0.1% Coomassie Brilliant Blue G-250和0.025 M HCl）和0.1 M NaOH，使试管底部的试剂混合均匀。
反应：将样品和标准品在室温下静置10分钟以上，使其反应趋势稳定。
测量吸光度：用比色计在595 nm处测量每个样品和标准品的吸光度。
计算浓度：用标准曲线计算出样品中蛋白质的含量。
然而，Bradford法存在一些局限性。首先，它对一些物质表现出不同的灵敏度，如阴离子、胆固醇等对其测量产生干扰；其次，多种条件（如pH、离子强度和表面活性剂等）可能影响其灵敏度范围，导致测量结果的失真；此外，尽管样品的含蛋白质量高，但测定过程中可能会出现低信号或高信号的干扰，导致测量误差。
3. 肽键定量法检测蛋白质含量
肽键定量法是一种通过化学还原反应测量蛋白质含量的方法。该方法基于肽键在酸性条件下被NaBH4还原成氨基酸的非共价结合，进而使用光学密度法（OD）定量测定氨基酸生成的比色物。与Bradford法不同，肽键定量法对酸性条件、还原剂和剂量的关系很敏感，需要较为精细的操作和实验技术。
具体操作流程如下：
样品制备：用无缓冲溶液（如6 M Guanidine HCl）洗涤生物样品，使其表面的蛋白质可溶于水。
标准曲线制备：用已知浓度的金氰化钠磷酸盐标准品制备一系列标准曲线。
还原反应：向每个标准品和样品试管中分别加入NaBH4试剂（含0.8 M NaBH4和0.1 M NaOH），在室温下静置一段时间，使样品中的肽键被还原成一定比例的氨基酸。
加入肼钠试剂：后加入已准备好的肼钠试剂（含0.05% 肼钠盐和1 M NaOH），混合摇匀。
测读吸光度：用比色计在570 nm处测量试管中的吸光度。
计算浓度：用标准曲线计算出样品中蛋白质的含量。
虽然肽键定量法具有极高的准确性和稳定性，但也存在一些不足之处。对于分子量大且含有较多的亲疏水基团的蛋白质，其测量灵敏度较低；其次，反应过程中会产生较多的氢气，可能造成压力影响和化学安全隐患；最后，此方法较为耗时、操作复杂，需要一定实验技术和仪器支持。
4. 两种方法比较和综合应用
Bradford法和肽键定量法都是测定蛋白质含量的基础方法，各有特点和应用范围。Bradford法操作简便，适用于多数蛋白质含量的定量，常用于常规品质控制和生化实验；而肽键定量法准确性高、结果可靠，但需要更多的时间和实验技术投入，通常用于科研领域或对比性研究中。因此，取决于研究目的和片段质量，两种方法在不同的情况下会有不同的优势和限制。
综上所述，测定蛋白质含量是生物学、药学等多个领域的基础工作之一。Bradford法和肽键定量法是较为常用的两种方法，各有其优缺点和适用范围。在实际应用中，选择合适的方法并注意操作实验技术的细节，是提高测定准确性、保证实验稳健性的关键。
